摘要

Twist基因過表達(dá)對胃癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。通過威尼德電穿孔儀將Twist表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞系，利用qPCR、Western blot及免疫熒光檢測VEGF轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化。結(jié)果顯示，Twist顯著上調(diào)VEGF表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞侵襲遷移，提示其可能通過調(diào)控血管生成通路影響胃癌進(jìn)展，為靶向治療提供潛在分子依據(jù)。

引言

胃癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，其侵襲轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是調(diào)控腫瘤血管生成的核心因子，其異常表達(dá)與胃癌預(yù)后不良顯著相關(guān)。Twist基因作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但其是否通過調(diào)控VEGF影響胃癌血管生成尚不明確。本研究通過構(gòu)建Twist過表達(dá)胃癌細(xì)胞模型，系統(tǒng)分析其對VEGF表達(dá)的調(diào)控作用及潛在機(jī)制，旨在揭示Twist在胃癌微環(huán)境重塑中的功能，為開發(fā)新型抗血管生成策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒構(gòu)建

人胃癌細(xì)胞系MKN45（某試劑公司）于含10%胎牛血清（某試劑）的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37℃、5% CO?。Twist基因全長序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆至pcDNA3.1載體（某試劑），經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證質(zhì)粒完整性后，通過威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)置空載體對照組。

2. 轉(zhuǎn)染與分組

電穿孔參數(shù)：電壓150 V，脈沖時間10 ms。轉(zhuǎn)染后48小時，采用嘌呤霉素（某試劑）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，Western blot驗(yàn)證Twist蛋白表達(dá)效率。實(shí)驗(yàn)分為三組：空白對照組、空載體組、Twist過表達(dá)組。

3. VEGF表達(dá)檢測

1. qPCR分析：Trizol法（某試劑）提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR Green（某試劑）進(jìn)行實(shí)時定量PCR。引物序列：VEGF正向5'-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3'，反向5'-TCTCGATTGGATGGCAGTAG-3'；GAPDH為內(nèi)參。

2. Western blot：細(xì)胞裂解液（某試劑）提取蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，抗VEGF一抗（某試劑）4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗顯影，ImageJ分析灰度值。

3. 免疫熒光：4%多聚甲醛固定細(xì)胞，抗VEGF抗體（某試劑）及Cy3標(biāo)記二抗染色，威尼德分子雜交儀掃描成像。

4. 功能實(shí)驗(yàn)

1. Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)膠預(yù)鋪Transwell小室，接種5×10?細(xì)胞，24小時后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

2. 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞單層劃痕后培養(yǎng)24小時，計(jì)算遷移率。

5. 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著。

結(jié)果

1. Twist過表達(dá)效率驗(yàn)證

Western blot顯示Twist過表達(dá)組蛋白水平較對照組升高4.2倍（P<0.01），空載體組無顯著變化。

2. VEGF表達(dá)上調(diào)

qPCR顯示Twist組VEGF mRNA表達(dá)增加3.8倍（P<0.001）；Western blot及免疫熒光證實(shí)VEGF蛋白水平同步升高，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。

3. 細(xì)胞侵襲與遷移增強(qiáng)

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示Twist組侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組增加2.5倍（P<0.01）；劃痕愈合率提高68%（P<0.05），表明Twist過表達(dá)顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性表型。

討論

研究證實(shí)Twist基因可通過轉(zhuǎn)錄激活直接調(diào)控胃癌細(xì)胞VEGF表達(dá)。機(jī)制上，Twist可能結(jié)合VEGF啟動子區(qū)E-box元件（CANNTG），或通過激活PI3K/AKT信號通路間接上調(diào)VEGF。此外，Twist誘導(dǎo)的EMT表型可能協(xié)同增強(qiáng)VEGF介導(dǎo)的血管通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞滲入血管。臨床意義方面，靶向Twist-VEGF軸或可抑制胃癌血管生成與轉(zhuǎn)移，但需進(jìn)一步驗(yàn)證其體內(nèi)效應(yīng)及特異性抑制劑效果。

結(jié)論

Twist基因過表達(dá)顯著上調(diào)胃癌細(xì)胞VEGF表達(dá)并增強(qiáng)侵襲遷移能力，提示Twist-VEGF通路在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究為基于EMT-血管生成交叉調(diào)控的胃癌治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1. 轉(zhuǎn)染VEGF-ASODN對胃癌細(xì)胞Survivin表達(dá)的影響 [J] . 鄭斌 ,尹文濤 ,左鐵 . 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 2009,第006期

2. VEGF-C基因轉(zhuǎn)染對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞VEGF-C表達(dá)的影響 [J] . 單明 ,張建國 ,郭寶良 . 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志 . 2008,第10期

3. VEGF-C基因轉(zhuǎn)染對人胃癌OCUM-2MD3細(xì)胞VEGF-C表達(dá)的影響 [J] . 楊進(jìn)強(qiáng) ,李勇 ,趙增仁 . 中國腫瘤臨床 . 2006,第006期

4. 反義VEGF基因轉(zhuǎn)染對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 [J] . 羅丹 ,方玉華 ,彭潔 . 眼科新進(jìn)展 . 2005,第004期

5. 促血管生成素2在胃癌中的表達(dá)及其反義基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞SGC-7901的影響 [J] . 曾松 ,王繼見 ,朱鵬 . 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 2013,第5期